在elisa實驗中經常會遇到ELISA實驗每次結果都不一樣情況。這種情況往往有多種因素影響，充分找到問題背后的不可靠因素，才能提高實驗結果的準確性。上海通蔚從elisa實驗準確性和可靠性因素為大家闡述！

  影響ELISA可靠性的因素

  能否持續(xù)產生準確結果，是Elisa檢測的可靠性。當同一樣本在相同條件下多次產生相同結果時，即為可靠的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。

  在使用ELISA技術進行血清學抗體檢測時，必須謹慎地理解ELISA的原理和可能存在的非特異性反應。在使用間接ELISA的抗體測定中，由于與抗原無關的各種原因，可能會出現(xiàn)假陽性和陰性反應。其中，最強烈的假陽性反應是由BG噪聲反應引起的，該反應是由樣本標本中的免疫球蛋白成分與固體表面的疏水結合引起的。BG噪聲反應在不同樣本之間可能存在較大差異，這種差異與樣本中免疫球蛋白的種類和數(shù)量有關，也與其他因素有關，例如固相表面性質、溶液環(huán)境等。在某些情況下，BG噪聲反應的強度甚至可能超過真正的抗體-抗原反應，導致假陽性結果。通過分析抗原未包被孔中的OD值并將其與抗原包被孔中獲得的值進行比較，可以輕松識別BG噪聲反應。遺憾的是，這一步經常被忽視，并且僅在抗原包被孔中確定OD值。

  ELISA檢測的可靠性會受到多種因素的影響，其中包括：

  1.試劑質量：抗體、酶和底物

  2.樣品或試劑受到污染

  3.過程中的時間長度和孵化溫度

  4.由于試劑處理和儲存不當導致降解和失去活性

  影響ELISA準確性的因素

  1.能否正確識別靶 抗原的存在與否，是ELISA檢測的準確性。在選擇試劑盒方面，高特異性和敏感性是非常重要！ 除此之外，要留意樣本問題、操作問題等來排除相關問題。

  2.檢測所用試劑（包括抗原、抗體和酶）的質量會影響準確性。如果使用質量差的試劑，可能會產生假陽性或假陰性結果。

  3.在樣品準備過程中，例如樣品的采集、儲存、處理和加工等錯誤，污染會影響測試結果的準確性。

  4.當測試檢測到與目標抗原或抗體相似但不相同的物質時，就會發(fā)生交叉反應。假設你正在使用ELISA檢測某種病毒的抗體。如果樣本中存在與該病毒抗體非常相似的其他病毒抗體，那么這些相似的抗體可能會與ELISA板上的抗原結合，產生一個信號。這會讓你誤以為樣本中存在目標病毒的抗體，實際上只是存在一個相似但不同的抗體。

  5.操作員未遵循制造商的說明而導致的錯誤

  6.通過選擇合適的樣品制備和選擇合適的試劑制備，可以最大限度地減少高背景噪音、不一致的結果和低信號強度。

  7.試劑盒靈敏度和特異性。試劑盒靈敏度低的檢測可能產生假陰性結果，而靈敏度高的檢測可能產生假陽性結果。特異性是指檢測方法能準確區(qū)分目標抗原或抗體和非目標物質的能力。在高特異性的檢測中，只有目標抗原或抗體會被識別并檢測到，而不會與相似但不同的物質產生反應。

  樣品制備

  根據(jù)樣本類型和期望的檢測結果選擇合適的方法非常重要。在樣本制備過程中，需要考慮一些常見干擾因素，例如樣本中可能存在與目標抗原結構類似的物質，導致交叉反應；或者樣本中存在與抗體發(fā)生非特異性結合的物質，例如血紅蛋白、脂類等；也可能存在目標物質與非目標物質的非特異性結合，例如目標物質與ELISA板的非特異性吸附。

  樣品質量、檢測條件（溫度和pH值）、孵育時間和試劑質量都會影響準確性。

  通過適當?shù)臉悠诽幚砗椭苽湟约笆褂每垢蓴_的檢測方式，可以最大限度地減少可能造成干擾的各種因素，通過適當?shù)臉颖咎幚砗椭苽?，例如離心去除紅細胞、使用抗體預處理方法、選擇特異性更高、交叉反應更小的抗體，以及使用抗干擾的試劑盒，可以最大限度地減少這些因素的影響，提高檢測結果的準確性。

  干擾ELISA檢測的因素可能出現(xiàn)在實驗過程的任何階段，從標本采集開始。酶標板、包被緩沖液、捕獲抗體、封閉緩沖液、靶 抗原、檢測抗體、酶聯(lián)物、洗滌液、底物、信號檢測的質量和完整性都可能干擾ELISA檢測的正常進行。

檢測優(yōu)化

  優(yōu)化涉及識別和最小化測定中的變異源，例如試劑濃度或孵育時間的變化。影響測定優(yōu)化的因素包括識別和最小化測定中的變異源，例如試劑濃度變化。這可以通過適當?shù)膶φ蘸蜏y試不同的試劑和條件組合來實現(xiàn)。系統(tǒng)方法、對照和驗證以及抗體、酶 底物系統(tǒng)和反應緩沖液pH的選擇可以提高ELISA測試的準確性。

  可以采用各種策略來優(yōu)化ELISA實驗，包括使用適當?shù)姆忾]緩沖液、優(yōu)化抗原濃度和檢測抗體濃度以及調整孵育時間和溫度。選擇確保優(yōu)化信噪比和測定動態(tài)范圍的試劑（酶和底物）非常重要。

  DoE是一種強大的工具，可以成功優(yōu)化任何受多種因素影響的過程。

  必須確保ELISA程序的標準化，以保持一致性。

   數(shù)據(jù)分析

  準確性和可靠性取決于選擇適當?shù)臄?shù)據(jù)標準化方法、識別和糾正異常值以及適當?shù)慕y(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。ELISA測試產生的數(shù)據(jù)通常很復雜，需要仔細分析以避免錯誤或偏差。

  數(shù)據(jù)標準化需要考慮初始樣品濃度的差異和測定條件的變化。標準化方法有多種，包括使用內標、陽性對照和樣品稀釋因子。其選擇應基于具體的實驗設計和測定要求。

  異常值可能由于技術錯誤或生物變異而出現(xiàn)，可以使用格魯布斯檢驗來識別，然后使用插值或代換法將其去除，并使用預期范圍內的值進行校正。

  統(tǒng)計方法的選擇應基于實驗設計、數(shù)據(jù)收集類型和要解決的研究問題。ELISA數(shù)據(jù)分析中使用的常見統(tǒng)計方法包括t檢驗、方差分析、回歸分析和相關性分析。

  ELISA測試結果準確可靠，這取決于適當?shù)臄?shù)據(jù)分析。遵循良好的實驗室規(guī)范（包括適當?shù)奈臋n和數(shù)據(jù)管理）至關重要，以確保數(shù)據(jù)的完整性和可重復性。

  測試了分析ELISA數(shù)據(jù)的不同方法，包括使用原始光密度(OD)值、標準化OD值和二分（陽性/陰性）結果。作者使用受試者工作特征(ROC)曲線和曲線下面積(AUC)分析比較了每種方法的靈敏度和特異性。

  OD值的標準化提高了結果的準確性和可靠性。建議使用非參數(shù)統(tǒng)計檢驗，例如Mann-WhitneyU檢驗，來評估組間差異并控制測定間變異性。建議使用對數(shù)轉換或樣本標準化等標準化技術來進一步控制測定間變異性。