在酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）中有多種ELISA類(lèi)型，其中較為常見(jiàn)的是直接和間接ELISA類(lèi)型，這兩種類(lèi)型大多數(shù)人往往會(huì)容易混淆，尤其是對(duì)于新手來(lái)說(shuō)。今天上海通蔚針對(duì)這個(gè)問(wèn)題寫(xiě)一篇直接和間接ELISA區(qū)別，對(duì)于剛拿到ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)人員選擇那種檢測(cè)類(lèi)型至關(guān)重要。

圖1 elisa類(lèi)型

  直接ELISA

  直接ELISA的主要優(yōu)勢(shì)在于其操作步驟簡(jiǎn)單、快速，并且在使用高特異性抗體的情況下，由于省去了二抗，可以減少由二抗帶來(lái)的非特異性結(jié)合及潛在的交叉反應(yīng)。它使用直接偶聯(lián)了酶標(biāo)記的一抗與目標(biāo)抗原結(jié)合。然而，直接ELISA的靈敏度通常較低，因?yàn)樗狈π盘?hào)放大步驟。每個(gè)抗原分子最多只能結(jié)合一個(gè)標(biāo)記的抗體，不像間接ELISA那樣，一個(gè)一抗可以結(jié)合多個(gè)標(biāo)記的二抗，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。因此，直接ELISA在檢測(cè)低豐度抗原方面可能存在困難。此外，直接ELISA需要為每個(gè)目標(biāo)抗原制備一種特異的酶標(biāo)記抗體，這限制了它的應(yīng)用范圍。

  雖然直接ELISA的應(yīng)用范圍不如間接ELISA廣泛，但在特定情況下，例如快速檢測(cè)、高豐度抗原檢測(cè)以及需要減少潛在交叉反應(yīng)性的場(chǎng)合，它仍然是一個(gè)有價(jià)值的工具。

  間接ELISA

  間接ELISA的主要優(yōu)勢(shì)在于其高靈敏度。由于二抗可以與一抗上的多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，使得即使在樣本抗原含量較低的情況下也能有效檢測(cè)。此外，間接ELISA具有很高的靈活性，因?yàn)榭梢允褂酶鞣N不同標(biāo)記的二抗與同一一抗配對(duì)，以適應(yīng)不同的檢測(cè)需求和平臺(tái)，無(wú)需重復(fù)標(biāo)記一抗。例如，研究人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇酶標(biāo)、熒光標(biāo)記或其他類(lèi)型的二抗。

  然而，間接ELISA也存在一些缺點(diǎn)。其中最主要的缺點(diǎn)是存在潛在的交叉反應(yīng)性。這是因?yàn)槎箍赡芘c樣品中除目標(biāo)抗原以外的其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，或者使用的二抗本身特異性不高，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。因此，選擇高質(zhì)量、高特異性的二抗對(duì)于減少交叉反應(yīng)至關(guān)重要。

  檢測(cè)抗體

  抗體在許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中起著至關(guān)重要的作用，例如ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）。ELISA利用抗體與目標(biāo)抗原特異性結(jié)合的特性來(lái)檢測(cè)和定量樣品中的抗原或抗體。ELISA的基本原理是將抗原或抗體固定在固相載體上，然后加入樣品和標(biāo)記的抗體（或抗原）。在ELISA中，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以使用直接標(biāo)記的抗體（直接ELISA）或未標(biāo)記的一抗和標(biāo)記的二抗（間接ELISA等）。

  在直接ELISA中，檢測(cè)抗體預(yù)先標(biāo)記有報(bào)告酶，如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)。當(dāng)標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合后，加入底物會(huì)引發(fā)酶促反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，例如顏色變化或化學(xué)發(fā)光。在一定濃度范圍內(nèi)，該信號(hào)的強(qiáng)度與樣品中抗原的濃度成正相關(guān)。

  為了確保ELISA結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，需要使用高度特異性的抗體，以最大限度地減少交叉反應(yīng)和非特異性結(jié)合，從而降低假陽(yáng)性率。制備高特異性抗體需要精心設(shè)計(jì)和嚴(yán)格的質(zhì)量控制。此外，ELISA的操作步驟，例如包被、洗滌和孵育，也需要嚴(yán)格控制，以確保結(jié)果的可靠性。

  常見(jiàn)問(wèn)題解答

  1.夾心ELISA與直接和間接ELISA有何不同？

  夾心ELISA使用兩種針對(duì)目標(biāo)抗原不同表位的抗體：一種未標(biāo)記的“捕獲”抗體包被在板上，用于捕獲抗原；另一種標(biāo)記的“檢測(cè)”抗體用于檢測(cè)結(jié)合到捕獲抗體的抗原。與直接或間接ELISA將抗原直接包被在板上不同，夾心ELISA通過(guò)兩種抗體的協(xié)同作用來(lái)提高特異性和靈敏度，尤其適用于復(fù)雜樣品中低濃度抗原的檢測(cè)。

  2.間接ELISA是否使用多種類(lèi)型的抗體？

  是的。間接ELISA使用兩種抗體：一種未標(biāo)記的“一抗”用于特異性結(jié)合目標(biāo)抗原，一種標(biāo)記的“二抗”用于檢測(cè)結(jié)合到抗原上的一抗。二抗是針對(duì)一抗物種來(lái)源的抗體，例如如果一抗是小鼠來(lái)源的，就需要使用抗小鼠的二抗。

  3.哪種ELISA更準(zhǔn)確？

  ELISA檢測(cè)的準(zhǔn)確性取決于多種因素，包括抗體的特異性和親和力、試劑的質(zhì)量、操作的規(guī)范性以及具體的檢測(cè)方案。一般而言，夾心ELISA由于使用了兩種抗體，通常比直接和間接ELISA具有更高的特異性和靈敏度。直接ELISA的步驟較為簡(jiǎn)單，但靈敏度較低，更適用于高濃度抗原的檢測(cè)。間接ELISA的靈敏度較高，但也更容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。選擇哪種ELISA方法需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求和目標(biāo)抗原的特性來(lái)決定。

  間接ELISA使用兩種抗體：一種未標(biāo)記的一抗特異性識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)抗原，另一種是標(biāo)記的二抗，用于檢測(cè)結(jié)合了抗原的一抗。

  與直接ELISA相比，間接ELISA可以顯著放大信號(hào)并提高靈敏度，因?yàn)槎鄠€(gè)二抗分子可以結(jié)合到一個(gè)一抗分子上，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)。然而，間接ELISA的操作步驟比直接ELISA更復(fù)雜，需要額外的二抗孵育和洗滌步驟，因此孵育時(shí)間也更長(zhǎng)。

  總而言之，直接和間接ELISA各有優(yōu)缺點(diǎn)。直接ELISA操作簡(jiǎn)便、快速，但靈敏度較低。間接ELISA靈敏度高，但操作步驟更復(fù)雜，耗時(shí)更長(zhǎng)，且存在潛在的交叉反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。選擇哪種方法取決于具體的實(shí)驗(yàn)需求和目標(biāo)。為了確保ELISA檢測(cè)的準(zhǔn)確性，需要仔細(xì)優(yōu)化各種實(shí)驗(yàn)條件，包括選擇高特異性和高親和力的抗體、合適的封閉劑、優(yōu)化的洗滌方案以及合適的底物和酶標(biāo)讀數(shù)儀等。