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ELISA技術(shù)支持

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ELISA實驗原理詳解

發(fā)布時間:2024-09-23     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實驗)是一種利用特異性抗體(抗原)反應(yīng)將目標抗原(抗體)結(jié)合在固相載體上,并利用酶標記的抗體(或抗原)進行檢測,并根據(jù)顯色反應(yīng)的強弱來定量樣品中目標物質(zhì)的含量。它是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法,目前廣泛應(yīng)用生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多種研究領(lǐng)域。


  ELISA實驗原理


  在ELISA中,將已知的抗原或抗體結(jié)合在固相載體表面,然后利用酶標記(偶聯(lián))的抗體或抗原與之孵育,測量加入底物后形成的產(chǎn)物的光吸收并將其轉(zhuǎn)換為數(shù)值來進行定性和定量分析。如果對定性和定量分析不是很理解,可以參考這篇文章《ELISA檢測試劑盒:定性與定量分析的優(yōu)勢比較》。根據(jù)抗原抗體結(jié)合,該檢測方法分為直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA法和競爭ELISA法等。


  直接ELISA


  原理:將目標蛋白(或目標抗體)固定在酶標板上,與針對該目標蛋白的酶標記抗體(或針對該目標抗體的特異性抗原)一起孵育,洗滌后,測量微孔板孔結(jié)合酶的活性。

直接elisa


  間接ELISA


  原理:將目標蛋白(或目標抗體)固定在酶標板上,隨后分兩步來進行檢測,先加入檢測抗體或抗原進行特異性結(jié)合。其次再加入酶標二抗檢測并利用底物顯色。

間接elisa


  夾心ELISA


  原理:將針對目標蛋白的抗體固定在酶標板,先與目標蛋白孵育,然后與另一種用酶標記的目標蛋白特異性抗體孵育。清洗后,測量微孔板孔結(jié)合酶的活性。

夾心ELISA


  競爭ELISA


  原理:將針對特定目的蛋白的抗體固定在酶標板,與含有目的蛋白的樣品以及已知量的酶標記的目的蛋白一起孵育,反應(yīng)結(jié)束后,測量微孔板孔結(jié)合酶的活性。


  當(dāng)樣品中的抗原水平較高時,抗體結(jié)合的酶標抗原水平較低,顏色較淺。相反,當(dāng)抗原水平較低時,抗體結(jié)合的酶標抗原水平較高,顏色較深。

競爭elisa


  上述是ELISA實驗原理步介紹,上述4ELISA法檢測原理有區(qū)別,在進行ELISA實驗時候,結(jié)合自己檢測目標及實驗需求進行選擇。如果想了解更多ELISA法區(qū)別,本篇幅有限,可以參考這篇文章《酶聯(lián)免疫試劑盒常見5種實驗檢測方法》。接下來以夾心法為列,詳細介紹下ELISA實驗步驟。


  1、試劑和設(shè)備的準備


  2、抗體的固定化


  將稀釋后的抗體加入96ELISA板的每個孔中,密封板以防止蒸發(fā),并在4°C下孵育15-18小時以固定抗體。


  3、洗滌


  除去稀釋的抗體,用洗滌液洗滌3次。


  4、封閉


  向每個孔中添加封閉緩沖液,并讓其在37°C下孵育1小時,以減少目標蛋白與孔的非特異性結(jié)合。


  5、洗滌


  除去封閉緩沖液,用洗滌液洗滌3次。


  6、樣品添加


  用樣品稀釋緩沖液稀釋樣品,并將每個樣品100μL添加到每個孔中。為制作校準曲線,在同一板上準備標準品的一系列稀釋液。將其在37°C下孵育1小時。


  7、洗滌


  取出樣品,用洗滌液洗滌5次。


  8、檢測抗體的添加


  用樣品稀釋緩沖液稀釋檢測抗體,每孔加入100μL,


  37°C孵育1小時。


  9、洗滌


  反應(yīng)結(jié)束后,去除檢測抗體,用洗滌液洗滌5次。


  10、酶標二抗的添加


  用樣品稀釋緩沖液稀釋酶標二抗,每孔加入100μL,


  37℃孵育1小時。


  11、洗滌


  反應(yīng)結(jié)束后,除去二抗,用洗滌液洗滌5次。


  12、添加底物溶液。


  孵育直至顏色顯現(xiàn)。


  13、用讀板器測量450nm處的吸收率。


elisa讀板器



  

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