酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay；也稱ELISA）用特異性抗體或抗原捕獲樣品溶液中所含的目標(biāo)抗原或抗體，利用酶反應(yīng)來捕獲目標(biāo)抗原或抗體樣品溶液中所含的物質(zhì)，這是一種檢測(cè)和定量的方法。

 

  利用抗原抗體反應(yīng)的各種組合，通過將酶標(biāo)記的抗原或抗體摻入反應(yīng)體系中，最終檢測(cè)酶活性為了檢測(cè)酶活性，使用吸收光譜根據(jù)反應(yīng)而變化的底物，并通過吸光度測(cè)量來定量。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的組合方式，有直接法、間接法、夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等方法。

 

  直接法

 

  直接ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）是一種基于板的免疫吸附測(cè)定，在檢測(cè)和定量特定分析物（例如抗原、抗體、蛋白質(zhì)、激素、肽等）來自復(fù)雜的生物樣品。在四種不同的ELISA格式中，直接ELISA是最簡(jiǎn)單、執(zhí)行速度最快的方法，但該方法也存在一些缺點(diǎn)（參見表1）。

 

  在直接ELISA中（圖1），抗原直接固定在多孔微量滴定板的表面，例如96孔聚苯乙烯板，然后與抗原特異性的酶標(biāo)記一抗復(fù)合。一旦酶標(biāo)記的一抗與抗原結(jié)合，綴合的一抗就會(huì)催化與其各自底物的反應(yīng)，產(chǎn)生可見的比色輸出，并通過分光光度計(jì)或吸光度酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量。直接ELISA適用于目標(biāo)樣品中的定性和定量抗原檢測(cè)、抗體篩選和表位作圖。

 

  圖1.說明直接ELISA的設(shè)置：

 

  1.通過被動(dòng)吸附將抗原固定在96孔聚苯乙烯板的孔上。

 

  2.將針對(duì)目標(biāo)抗原特異的酶標(biāo)記一抗（例如HRP標(biāo)記一抗）添加到孔中并直接與抗原結(jié)合。

 

  3.添加相應(yīng)的酶底物（例如TMB(11012)，一種適合HRP的底物），與酶反應(yīng)后，產(chǎn)生可以通過分光光度計(jì)或吸光度酶標(biāo)儀測(cè)量的可見比色輸出。

 

  優(yōu)點(diǎn)：

 

  ?需要更少的試劑和更少的步驟，使這種ELISA格式簡(jiǎn)單快速，同時(shí)最大限度地減少潛在的用戶錯(cuò)誤

 

  ?消除二抗的交叉反應(yīng)性

 

  缺點(diǎn)：

 

  ?抗原固定不具有特異性，導(dǎo)致潛在的高背景干擾

 

  ?一抗必須單獨(dú)標(biāo)記，既耗時(shí)又昂貴

 

  ?無信號(hào)放大

 

  ?靈活性低——每種靶蛋白都需要特定的偶聯(lián)一抗

 

  ?一抗的免疫反應(yīng)性可能會(huì)受到酶標(biāo)記的不利影響

 

  間接法

 

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)可以通過對(duì)其基本方案進(jìn)行各種修改來完成。例如，直接ELISA使用酶標(biāo)記一抗綴合物來檢測(cè)固定化抗原。然而，由于它只是1:1的化學(xué)計(jì)量比，因此放大或提高信號(hào)強(qiáng)度以方便或讀取以及更精確的測(cè)量是不可能的。

 

  間接ELISA在基線直接ELISA過程的基礎(chǔ)上又增加了一個(gè)步驟。選擇的抗原與實(shí)驗(yàn)表面結(jié)合，并添加對(duì)其具有特異性的未標(biāo)記一抗并與抗原結(jié)合。隨后，添加酶標(biāo)記的二抗并與一抗結(jié)合。這不僅提供了可定制的信號(hào)，而且使特定實(shí)驗(yàn)的過程具有更大的適應(yīng)性，因?yàn)槎箍梢葬槍?duì)多個(gè)一抗。將無色底物引入樣品中，與酶綴合物發(fā)生反應(yīng)，并產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇，該副產(chǎn)物可以是比色、化學(xué)發(fā)光或熒光的。

 

  研究人員在決定實(shí)驗(yàn)方案中包含哪種檢測(cè)時(shí)必須考慮多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。下表列出了間接ELISA權(quán)衡的一系列因素。

 

  圖2說明比色間接ELISA的設(shè)置：

 

  1.用測(cè)試抗原包被ELISA板，密封板并在4°C下孵育過夜

 

  2.除去包被溶液并用所需緩沖液洗板2次

 

  3.用所需的封閉溶液在4°C下封閉板1小時(shí)

 

  4.用緩沖液洗板2次

 

  5.與未偶聯(lián)的一抗在室溫下孵育1小時(shí)

 

  6.用緩沖液洗板4次

 

  7.與HRP標(biāo)記的二抗（在封閉緩沖液中）在室溫下孵育1小時(shí)

 

  8.用緩沖液洗板4次

 

  9.用ReadiUse?TMB底物溶液（貨號(hào)11012）在室溫下孵育板15-30分鐘。

 

  10.使用Signal Guard?HRP反應(yīng)終止液終止反應(yīng)（貨號(hào)11020）

 

  11.使用ELISA酶標(biāo)儀測(cè)量650 nm處的吸光度信號(hào)

 

  優(yōu)點(diǎn)：

 

  ?易于獲取——多種預(yù)標(biāo)記二抗可供選擇

 

  ?經(jīng)濟(jì)–需要更少的標(biāo)記抗體

 

  ?高靈敏度–一抗含有多種表位，可結(jié)合多種標(biāo)記二抗，從而導(dǎo)致信號(hào)放大

 

  ?非常靈活–單個(gè)二抗可用于檢測(cè)不同的一抗

 

  ?保留一抗的最大免疫反應(yīng)性

 

  ?不同的可視化標(biāo)記物可以與相同的一抗一起使用（例如生物素/鏈霉親和素）

 

  缺點(diǎn)：

 

  ?二抗的潛在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致非特異性染色

 

  ?與直接ELISA格式相比，實(shí)驗(yàn)方案更長(zhǎng)，因?yàn)樵撨^程需要額外的孵育步驟

 

  三明治法

 

  三明治ELISA是許多研究應(yīng)用中最受歡迎的檢測(cè)選擇，它是獨(dú)一無二的。雖然它也像間接ELISA一樣使用兩種抗體與目標(biāo)抗原結(jié)合，但其中一種抗體將首先用于包被實(shí)驗(yàn)表面。微孔板徹底包被后，將目標(biāo)抗原添加到樣品孔中并與第一抗體結(jié)合。然后將第二個(gè)抗體添加到微孔板中并與目標(biāo)抗原結(jié)合，從而有效地將目標(biāo)蛋白“夾在”兩個(gè)抗體之間。該測(cè)試具有高度特異性、高度靈敏性，并且具有不需要任何形式的樣品純化的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)橹挥心繕?biāo)抗原會(huì)受到兩種抗體的影響，從而能夠獲得出色的分析物濃度實(shí)驗(yàn)讀數(shù)。然而，尋找合適配對(duì)抗體的費(fèi)用和困難是主要的缺點(diǎn)。

 

  競(jìng)爭(zhēng)法

 

  競(jìng)爭(zhēng)/抑制ELISA解決了從與任何其他檢測(cè)版本相反的方向測(cè)量樣品中分析物濃度的問題。首先，使用已知抗原包被微孔板樣品孔。其次，添加測(cè)試樣品材料，最后引入酶標(biāo)抗體以檢測(cè)結(jié)果。由于測(cè)試分析物與酶標(biāo)抗體“競(jìng)爭(zhēng)”結(jié)合，因此分析物的存在將降低與其濃度相稱的信號(hào)輸出。這種反向方法還允許測(cè)試未知樣品而無需純化，并且適用于廣泛的實(shí)驗(yàn)。該技術(shù)的復(fù)雜性和難度與間接或夾心ELISA方案在時(shí)間和費(fèi)用方面相似。

 

  上述為大家介紹elisa幾種常見的分類，每種分類有各自的特點(diǎn)，大家可以根據(jù)自身的情況選擇屬于自己elisa試劑盒的方法。