酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)因其高靈敏度而受到青睞，能夠檢測(cè)出非常低濃度的物質(zhì)（低至每毫升0.0001-0.01毫克）。它廣泛用于查找和測(cè)量肽、蛋白質(zhì)、抗體、激素、藥物和潛在的食物過(guò)敏原，如牛奶、花生和雞蛋，這些對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)很重要。它的工作原理是利用抗原和抗體之間的特定相互作用，以及產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的酶。ELISA于20世紀(jì)70年代開發(fā)，利用抗體的精確度和酶的活性來(lái)分析生物樣本，從而提供一種靈敏而具體的方法。隨著時(shí)間的推移，ELISA不斷改進(jìn)以提高其靈敏度，現(xiàn)在有不同類型的ELISA來(lái)檢測(cè)各種生物標(biāo)志物。

  Elisa實(shí)驗(yàn)方案：

  一、涂層：

  涂層將抗原或捕獲抗體固定在微量滴定板上。

  這是通過(guò)將培養(yǎng)皿與含有抗原或抗體的溶液一起孵育來(lái)完成的。

  抗原或抗體的選擇取決于具體的應(yīng)用和靶分子。

  適當(dāng)?shù)臐舛群头跤龝r(shí)間對(duì)于成功的檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。

  二、阻塞：

  阻斷可防止微量滴定板上的非特異性結(jié)合。

  降低背景噪音并提高檢測(cè)特異性。

  用一抗或抗原包被后，向孔中添加封閉蛋白（例如，BSA、酪蛋白或牛奶）。

  阻斷蛋白質(zhì)與未占據(jù)的位點(diǎn)結(jié)合，減少非特異性結(jié)合。

  孵育培養(yǎng)板以允許阻斷蛋白結(jié)合，然后用緩沖液洗去多余的蛋白。

  阻斷后，可將一抗或抗原添加到孔中。

  三、樣品和標(biāo)準(zhǔn)添加：

  標(biāo)準(zhǔn)通常是一組已知濃度的抗原，用于生成校準(zhǔn)曲線。

  將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品添加到板的單獨(dú)孔中，而將未知樣品添加到重復(fù)的或重復(fù)的三孔中。

  四、一抗孵育：

  此步驟涉及添加特定的一抗以結(jié)合微量滴定板上的抗原。

  一抗通常來(lái)自特定物種（例如小鼠或兔）并且可以被標(biāo)記或未標(biāo)記。

  如果一抗未標(biāo)記，則稍后添加與酶（例如HRP或AP）偶聯(lián)的二抗以產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。

  五、二抗孵育：

  一抗-抗原復(fù)合物將二抗連接至微量滴定板。

  這種連接使得酶能夠與底物結(jié)合并產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。

  來(lái)自酶偶聯(lián)二抗的信號(hào)與樣品中一抗或抗原的量成比例。

  六、底物添加：

  底物與二抗偶聯(lián)的酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，該信號(hào)可使用微孔板讀數(shù)儀進(jìn)行量化。

  顯色底物會(huì)產(chǎn)生可在特定波長(zhǎng)下讀取的有色反應(yīng)產(chǎn)物，而化學(xué)發(fā)光底物則會(huì)發(fā)出光，可通過(guò)光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。

  應(yīng)優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間和底物濃度以產(chǎn)生足夠的信號(hào)而不引起背景噪音。

  七、停止解決方案：

  常用的終止溶液是硫酸，在底物孵育步驟后將其添加到孔中。

  添加終止溶液對(duì)于確保反應(yīng)不再繼續(xù)以及產(chǎn)生的信號(hào)穩(wěn)定且可重復(fù)至關(guān)重要。