酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是利用抗原、抗體的特異性免疫反應與酶的催化反應相結(jié)合建立起來的一項免疫檢測技術。而包被是ELISA實驗第一步，也是比較關鍵的一步。ELISA包被是指將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程，也稱為固相化。這個載體可以是96孔板，也可能是磁珠或其他材料。接下來，上海通蔚生物為大家介紹下酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）中優(yōu)化包被的方法。

圖1 為直接ELISA原理

  1、選擇合適的包被抗原

  包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原。天然蛋白直接從生物樣本中提取的抗原，例如細菌、病毒或細胞等。這類抗原最接近自然狀態(tài)，但也容易混雜其它物質(zhì)，需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對于含有雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標板上，再通過特異性反應使抗原固相化）；重組蛋白利用基因工程技術，在宿主細胞中表達的抗原。這類抗原純度較高，特異性好，一般可以直接包被即可；小分子抗原，例如多肽以及一些小分子有機化合物由于分子量小，缺乏足夠的結(jié)合位點，直接包被的效果往往不盡如人意，一般我們會采用載體蛋白偶聯(lián)法。將小分子抗原偶聯(lián)到分子量較大、具有較多結(jié)合位點的載體蛋白上，例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等，借助載體蛋白的吸附能力實現(xiàn)間接包被。

  2、選擇合適的包被液

  常見的包被液有碳酸鹽緩沖液和 磷酸鹽緩沖液。碳酸鹽緩沖液最常用的ELISA包被液之一。pH值范圍一般在9.0-9.6之間，呈弱堿性；磷酸鹽緩沖液pH值范圍一般在7.2-7.4之間，接近生理pH值。如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話，可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。

  3、包被的溫度

  常見的包被溫度室溫（18-25°C）、 4°C(冷藏)和37°C(孵育箱)。室溫（18-25°C）適用于大多數(shù)抗原和抗體。室溫包被操作簡便，通常需要過夜包被(12-16小時)，或在搖床上孵育2-4小時； 4°C(冷藏)這種方法可以最大程度地保持其生物活性，但需要更長的包被時間，通常需要過夜包被(16-24小時)； 37°C(孵育箱)這種方法可以縮短包被時間，但可能會增加一些不穩(wěn)定的抗原或抗體變性失活的風險。具體可以參考試劑盒說明書或相關文獻來了解目標抗原或抗體的最佳包被條件。

  4、包被濃度選擇

  選擇合適的包被濃度對ELISA實驗成功至關重要。過高過低的濃度都會影響實驗的靈敏度、特異性和準確性。根據(jù)經(jīng)驗估計初始濃度，一般來說，蛋白質(zhì)抗原和抗體的包被濃度范圍在1-10μg/mL之間。小分子抗原包被濃度可能需要更高一些，例如5-20μg/mL，因為其分子量較小，結(jié)合位點較少。關于包被合適的濃度，大家可以參考具體的說明書或相關文獻，也可以通過預實驗優(yōu)化包被濃度，例如梯度稀釋法和分析結(jié)果法等。

  5、包被后的封閉選擇

  ELISA板的表面會殘留一些未被包被抗原/抗體占據(jù)的位點，這些位點容易吸附后續(xù)步驟中加入的檢測抗體、酶標抗體等試劑，造成非特異性結(jié)合，導致背景信號增高，影響結(jié)果判斷。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉等。大家可以進行預實驗，比較不同封閉液的封閉效果，選擇最佳的封閉液。

  上述是通蔚生物為大家介紹elisa實驗包被優(yōu)化的方法，通過了解ELISA包被的優(yōu)化方法，可以提升實驗效果。如果您對ELISA實驗還有疑問，歡迎咨詢我們在線顧問。