什么是PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）？PCR 是一種在實(shí)驗(yàn)室中使用的技術(shù)，用于復(fù)制特定 DNA 片段的數(shù)百萬(wàn)個(gè)副本。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 最初由美國(guó)生物化學(xué)家 Kary Mullis 于 1983 年開發(fā)。因其開創(chuàng)性工作，他于1993年榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在Covid-19 大流行期間，通過PCR技術(shù)檢測(cè)一個(gè)人是否感染該病毒。
  

  PCR是如何工作呢？

  

    PCR反應(yīng)體系及作用

  1、要復(fù)制的 DNA 模板。
  
  2、引物——DNA 或 RNA 的短片段，長(zhǎng)度為 20 到 30 個(gè)堿基，結(jié)合感興趣的 DNA 片段的任一側(cè)并標(biāo)記 PCR 的起始點(diǎn)。
  
  3、DNA 核苷酸堿基（也稱為 dNTP）。 DNA 堿基（A、T、C 和 G）是 DNA 的組成部分，是構(gòu)建新 DNA 鏈所必需的。
  
  4、一種稱為 Taq 聚合酶的酶，它將堿基添加到復(fù)制的序列中。
  

  5、緩沖液以確保反應(yīng)有合適的條件。

PCR步驟

  
  PCR 具有三個(gè)主要階段，其中涉及加熱和冷卻過程：
  
  步驟1，變性：將雙鏈模板DNA加熱，使其分離成兩條單鏈。
  
  步驟2，退火：降低溫度，使DNA引物附著到模板DNA上。
  
  第三步，延伸：再次升高溫度，Taq聚合酶產(chǎn)生新的DNA鏈。
  
  這三個(gè)階段重復(fù) 20-40 次，每次 DNA 拷貝數(shù)加倍。這稱為熱循環(huán)，由機(jī)器執(zhí)行。
  
  它是由一臺(tái)稱為熱循環(huán)儀的機(jī)器執(zhí)行的。根據(jù)機(jī)器的速度，PCR 可以在不到一小時(shí)或長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。
  

  PCR 完成后，可以使用一種稱為電泳的方法來(lái)檢查產(chǎn)生的 DNA 片段的數(shù)量和大小。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 中主要步驟的插圖

  

  PCR 的每個(gè)步驟詳解

  
  第一步：變性
  
  將反應(yīng)混合物加熱至 94-95°C，持續(xù) 15 至 30 秒。
  
  高溫導(dǎo)致模板 DNA 兩條鏈中堿基之間的氫鍵斷裂，兩條鏈分離。
  
  這會(huì)產(chǎn)生兩條單鏈 DNA，它將作為模板產(chǎn)生每條 DNA 鏈的新副本。
  
  重要的是，在此階段保持溫度足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以確保 DNA 鏈完全分離。
  
  第 2 步：退火
  
  將反應(yīng)冷卻，使引物能夠通過氫鍵連接到單鏈模板 DNA 上的特定位置。
  
  溫度取決于底漆的特性，但通常在 50 至 65?C 之間。
  
  兩條分離的 DNA 鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，并且以相反的方向延伸（從一端 – 5' 端 – 到另一端 – 3' 端）。因此，有兩種引物——正向引物和反向引物。
  
  此步驟至關(guān)重要，因?yàn)橐锿ㄟ^提供供聚合酶使用的短雙鏈 DNA 區(qū)域而充當(dāng) DNA 合成的起點(diǎn)。只有引物結(jié)合后，聚合酶才能附著并開始在延伸步驟中從松散的 DNA 堿基生成新的互補(bǔ) DNA 鏈。
  
  退火步驟通常需要大約10-30秒。
  

  第三步：擴(kuò)展

  
  熱量升至 72?C，以便通過添加 DNA 堿基的特殊 Taq DNA 聚合酶生成新 DNA。
  
  Taq DNA 聚合酶是一種取自水生棲熱菌 (“Taq”) 的酶：
  
  這種細(xì)菌通常生活在溫泉中，可以耐受80℃以上的溫度，但最適溫度為72℃。
  
  該細(xì)菌的 DNA 聚合酶在高溫下非常穩(wěn)定，這意味著它可以承受在 PCR 變性階段將 DNA 鏈分開所需的溫度。
  
  大多數(shù)其他生物體的 DNA 聚合酶無(wú)法承受如此高溫。例如，人類聚合酶在 37°C（體溫）下工作效果最佳。
  
  在 72?C 時(shí)，Taq 聚合酶開始構(gòu)建互補(bǔ)鏈。它附著在引物上，然后沿 5' 到 3' 方向?qū)?DNA 堿基一一添加到單鏈上。
  
  結(jié)果是一條全新的 DNA 鏈和雙鏈 DNA 分子。
  
  此步驟的持續(xù)時(shí)間取決于被擴(kuò)增的 DNA 序列的長(zhǎng)度。復(fù)制 1,000 個(gè) DNA 堿基通常需要大約一分鐘。
  
  第四步：重復(fù)該過程
  
  這三個(gè)熱循環(huán)過程重復(fù) 20-40 次，以產(chǎn)生大量感興趣的 DNA 序列的副本。
  
  PCR 過程中產(chǎn)生的新 DNA 片段也可以作為 DNA 聚合酶可以附著并開始產(chǎn)生 DNA 的模板。
 

  結(jié)果是在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量特定 DNA 片段的拷貝。

插圖顯示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 如何產(chǎn)生大量 DNA 副本

  上述是通蔚為大家介紹了什么是PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），了解PCR原理及步驟，有助于計(jì)和執(zhí)行PCR實(shí)驗(yàn)操作。如果您對(duì)PCR還有疑問，歡迎前來(lái)咨詢。