了解ELISA實(shí)驗(yàn)原理及步驟有助于科研人員準(zhǔn)確、高效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作與結(jié)果分析，提升科研能力。今天，上海通蔚生物從ELISA實(shí)驗(yàn)原理及步驟出發(fā)來(lái)講一講，有助于大家對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)有全面了解。

  ELISA實(shí)驗(yàn)原理

  酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，或稱ELISA，是一種常用的血清學(xué)檢測(cè)方式，接下來(lái)這篇文章為大家詳細(xì)介紹其工作原理，請(qǐng)拿好小板凳來(lái)做筆記。

  ELISA血清學(xué)檢測(cè)法通常是在多孔微量板中進(jìn)行，這樣可以很方便的進(jìn)行血清的稀釋和檢測(cè)。在進(jìn)行檢測(cè)前，先用目標(biāo)抗原包被多孔板的每個(gè)孔。對(duì)于商業(yè)化的檢測(cè)，制造商會(huì)把這個(gè)步驟先做好。

  開始檢測(cè)時(shí)，我們會(huì)在每個(gè)孔中加入稀釋過(guò)的患者血清，如果病人血清中有相應(yīng)的抗體存在，它們會(huì)與固定在孔底的抗原結(jié)合。接著，用緩沖液沖洗出未和目標(biāo)抗原結(jié)合的抗體。然后，加入含有動(dòng)物抗體的溶液（注；此動(dòng)物抗體是能夠抗人體的抗體的）。這第二種抗體（既動(dòng)物抗體）上共價(jià)結(jié)合了一個(gè)酶。

  再次清洗這些孔，這次是為了出去未結(jié)合的沒(méi)標(biāo)記的抗體。最后，加入顯色溶液，這樣溶液含有一種被酶催化顯示的底物。底物與第二種抗體上的酶相互作用，可以使溶液呈現(xiàn)明顯顏色。因著不同濃度的目標(biāo)抗體存在，孔槽溶液會(huì)產(chǎn)生不同程度的顏色變化。這樣的顏色變化，可以通過(guò)肉眼觀察和儀器定量讀取每個(gè)孔中的特定抗體的顯色結(jié)果。血清濃度隨著稀釋而降低，能夠和抗體產(chǎn)生反應(yīng)的抗體濃度也因而隨之下降。

  所以顏色變化也因而由濃變淡。能出現(xiàn)顯色反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)就是所測(cè)樣品的效價(jià)。

  ELISA實(shí)驗(yàn)步驟

  在開始做ELISA實(shí)驗(yàn)之前，我們先理一下需要哪些準(zhǔn)備。需要準(zhǔn)備包括：

  實(shí)驗(yàn)用品：

  藥品：稀釋液、酶標(biāo)二抗、底物、陽(yáng)性血清、陰性血清、終止液

  器材：抗原板、稀釋版、待檢血清、加樣槽、移液槍、加樣儀、酶標(biāo)儀、恒溫箱

  在做實(shí)驗(yàn)時(shí)候，我們要準(zhǔn)備一個(gè)實(shí)驗(yàn)本，在做實(shí)驗(yàn)之前把這次實(shí)驗(yàn)步驟理順，然后根據(jù)我們相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)所反饋的結(jié)果要實(shí)時(shí)的登記在我們實(shí)驗(yàn)記錄本上面。接下來(lái)給大家詳細(xì)說(shuō)下實(shí)驗(yàn)步驟：

  步驟一：首先我們要根據(jù)我們的血清量，合理的吸取相應(yīng)的稀釋液的量加入我們的稀釋板里面。

  我們用多道移液槍到我們稀釋板里面（調(diào)到適當(dāng)?shù)牧砍蹋└鶕?jù)我們反應(yīng)要求的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，用排槍將稀釋液吸入板中（注：在吸入過(guò)程要保證排槍的槍頭里面的稀釋液處于同一水平）。

  然后，在使用微量移液槍調(diào)取我們所需要的量程，按順序吸取適量的待檢測(cè)血清，加入稀釋板的稀釋液中。依次類推，將所有的待檢血清依次加入對(duì)應(yīng)的稀釋板中。

  加入完后，最后加入陽(yáng)性血清和陰性血清。使用排槍將加入好的血清和稀釋液混勻過(guò)后對(duì)比加入抗原板中，將加入完抗原板用密封袋密封后放入37度的恒溫箱中，孵育40分鐘（注：不是所有孵育時(shí)間都是40分鐘，可以根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行孵育），待40分鐘孵育完畢后，將抗原板取出，將抗原板內(nèi)稀釋液倒掉，然后用加樣儀加入洗滌液，按照使用要求，將抗原板洗滌3-4次。每次加入洗滌液之后，都要將洗滌液倒出，然后在加入洗滌液，依次類推，當(dāng)?shù)谒拇渭尤胪戤吅?，將板?nèi)洗滌液在書本或者桌布上面進(jìn)行相對(duì)的拍干（注：板子相對(duì)拍干過(guò)后與下一次的試劑加入的間隔時(shí)間不易太久）。

  步驟二：加入酶標(biāo)二抗。用拍槍版將酶標(biāo)二抗加入抗原板中，加入完畢后，用密封袋密封過(guò)后放入37度恒溫箱中孵育40分鐘。孵育完畢后，將抗原板拿出倒掉酶標(biāo)二抗，然后加入洗滌液，將抗原板洗滌3-4次。倒掉過(guò)后拍干。

  步驟三：加入底物（注意：底物一般為避光試劑，在加熱過(guò)程應(yīng)保證整個(gè)過(guò)程是快速的）。將底物加入抗原板中，加入完畢后，直接放入37度恒溫箱中進(jìn)行孵育，此過(guò)程不需要密封袋進(jìn)行密封。將底物拿出，底物的孵育時(shí)間一般為10-15分鐘。

  步驟四：加入終止液。加入完后，可以用酶標(biāo)儀讀數(shù)，一般要將數(shù)據(jù)導(dǎo)入U盤進(jìn)行整理。

  上述為大家整理了elisa實(shí)驗(yàn)原理及步驟，大家可以作為參考。大家在做elisa實(shí)驗(yàn)時(shí)候可以結(jié)合自己的說(shuō)明書進(jìn)行。如果您還有疑問(wèn)，可以在線咨詢我。

  上海通蔚生物一直致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù)，滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實(shí)驗(yàn)需求。